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本试剂盒适用于从各种昆虫细胞和各种昆虫实体组织中提取核蛋白和胞浆蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。制备的核蛋白和胞浆蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞核膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。如果下游应用是金属螯和层析等不能含EDTA试剂的实验，可以联系我公司更换不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒提取的蛋白含高浓度盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用其他货号的试剂盒。也可将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（HR0389）。

• 使用方便，从细胞/组织中提蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至30分钟～1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 蛋白酶抑制剂未开盖前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 如果试剂不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 细胞蛋白提取
  
  • 提取液准备：
    每500μL蛋白提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    每500μL蛋白提取液B中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完，再次用前需再次加入蛋白酶抑制剂。
    
  • 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    注：
    ● 细胞数量根实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请据实际情况调整。
    
  • 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    
  • 每5～10×106中加入400μL冷的提取液A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2～8℃条件振荡20～30分钟。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液稍微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 然后在4℃，12000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
    
  • 沉淀用PBS洗涤一次，然后在4℃，10000×g条件下离心5分钟，弃上清。
    
  • 在沉淀中加入200μL冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。
    注：
    ● 根据后面和蛋白浓度测定的情况，可调整使用量，一般在50～200μL。
    
  • 置2～8℃条件振荡30分钟，至沉淀明显减少甚至无明显沉淀。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液稍微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 在4℃，14000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
    
  • 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
• 组织蛋白提取
  
  • 提取液制备：
    每500μL蛋白提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    每500μL蛋白提取液B中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完，再次用前需再次加入蛋白酶抑制剂。
    
  • 取适量昆虫组织，用手术剪刀尽可能剪碎，加冷PBS，用组织匀浆机/匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
    注：
    ● 果蝇等小型昆虫可以剪碎后直接匀浆处理。
    ● 较大的昆虫需要去除翅膀、腿、甲壳等。
    
  • 在4℃，500×g条件下离心3分钟，弃上清。
    
  • 每20～50μL细胞压积（沉淀体积）中加入200μL冷的提取液A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2～8℃条件振荡20～30分钟。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液稍微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    ● 也可按组织重量计，每20mg加200μL提取液A。
    
  • 然后在4℃，12000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
    
  • 沉淀用PBS洗涤一次，然后在4℃，10000×g条件下离心5分钟，弃上清。
    
  • 在沉淀中加入100～200μL冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。
    
  • 置2～8℃条件振荡30分钟。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液稍微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
    
  • 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 核蛋白浓度低？
  核蛋白丰度较低，需要足够细胞数量提取，在条件允许情况下，尽可能加大细胞量。
  注意用蛋白提取液AB处理时没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂AB的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀，至无明显沉淀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂B中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。